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衰老的内膜泡沫细胞在动脉粥样硬化的整个过程中都是有害的

衰老的内膜泡沫细胞在动脉粥样硬化的整个过程中都是有害的

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译者:qinglanhe 原文作者:Bennett G. Childs,1 Darren J. Baker,2 Tobias Wijshake,2,3 Cheryl A. Conover,4 Judith Campisi,5,6 and Jan M. van Deursen1,2,*
发布:2017-05-08 09:07:20 挑错

Science. 2016 Oct 28; 354(6311): 472–477.Published online 2016 Oct 27. doi: 10.1126/science.aaf6659

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5112585/

qinglanhe译

摘要

晚期的动脉粥样硬化病变包含一些衰老细胞,但是这些细胞在动脉粥样硬化形成中所起的作用仍不清楚。我们利用转基因和药理学方法,在剔除衰老细胞的易于引起动脉粥样硬化的Ldlr(低密度脂蛋白受体)缺陷(Ldlr -/-)小鼠中,证明这些细胞在整个疾病发生过程中是有害的。我们发现,在动脉粥样硬化发生时的内皮下空间积聚了具有衰老标记的泡沫状巨噬细胞,它们在此通过增加关键的导致动脉粥样硬化形成和炎性细胞因子及趋化因子的表达,驱动病理过程。晚期病变中,衰老细胞促进斑块的不稳定性,包括通过提高金属蛋白酶的产生,使弹性纤维退变和纤维帽变薄。总之,这些结果表明,衰老细胞是粥样斑块形成和成熟的关键驱动力,同时表明通过一些分解剂来清除这些衰老细胞的方法,有望用于动脉粥样硬化的治疗。

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 常常由于血液中载有脂蛋白的载脂蛋白B水平的异常升高,当动脉内皮下空间被氧化的脂蛋白浸润时,就开始发生动脉的粥样硬化⑴。由激活的内皮细胞和平滑肌细胞产生的趋化信号,引起循环的单核细胞发育为载脂的泡沫状巨噬细胞,其中的一个亚群,通过一个尚不完全了解的机制具有促炎的表型。这种促炎信号,导致数轮单核细胞的征募和其他炎性细胞的积聚(包括T和B细胞、树突状细胞和肥大细胞),使通常称为“脂肪条纹”的病变开始发生,从而,使体积增大发展成为斑块⑵。是斑块的稳定性而不是其绝对的大小,决定了该动脉粥样硬化在临床上表现或不表现症状,因为只有不稳定的斑块发生破裂而堵塞血管的血栓,才使其末端器官造成损害。稳定的斑块,具有相对厚度的纤维帽,它主要由血管平滑肌细胞(VSMCs)和细胞外基质成分、来自斑块中血栓形成分子的部分可溶性凝血因子组成⑶。晚期病变中,当局部基质的金属蛋白酶产生水平升高时,使纤维帽降解,就增加了病变破裂的风险,而随之形成血栓。

晚期斑块包含具有衰老标志的细胞,应激反应引起永久的生长抑制,结合大量的生物学活性因子的强劲分泌,被称为与衰老相关的分泌表型(SASP)。衰老标志包括活性升高的与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SAβ-Gal)和P16Ink4a、P53及P21的表达(4,5)。然而,衰老细胞是否以及如何导致动脉粥样硬化形成尚不清楚(6,7)。人类斑块包含端粒缩短的细胞,这些细胞倾向于发生衰老⑻。老化的促动脉粥样硬化形成作用,是与在血管平滑肌细胞(VSMC)中观察到的端粒结合蛋白(Trf2)功能丧失的表达相一致的,虽然在活体斑块中尚未提供增强衰老的证据,不过却加速了动脉粥样硬化ApoE -/-小鼠模型中斑块的生长。另一方面,小鼠缺乏衰老通道中的核心成分例如P53、P21或P19Arf(7,9-11),显示了动脉粥样硬化的加速,意味着这些成分对衰老的保护作用。这些研究显示,人和小鼠的P16Ink4a和P14Arf(小鼠中为P19Arf)的多态性表达降低是和粥样斑风险提高相关联的,表明支持这个结论(7,12,13)。因此,衰老细胞是否加速或延缓粥样硬化的形成是尚不清楚的。

我们使用遗传的和药理学的方法,剔除衰老细胞以检查在不同的动脉粥样硬化形成阶段自然发生衰老的细胞所发挥的作用。首先,我们证实在一个动脉粥样硬化形成模型LDL受体缺失(Ldlr -/-)小鼠中衰老细胞的积聚。我们给10周龄Ldlr-/-小鼠饲喂高脂日粮(HFD)达88天。然后进行衰老相关的半乳糖苷酶(SAβ-Gal)染色,染色显示在动脉粥样硬化病变中存在衰老细胞,不过,正常的邻近血管中或饲以低脂日粮(LFD)的Ldlr -/-小鼠的主动脉中则没有(图.S1A)。此外,富含斑块的主动脉弓中P16Ink4a、P19Arf和各种典型的SASP(衰老相关分泌表型)成分,包括基质金属蛋白酶Mmp3和Mmp13及炎性细胞因子II1α和Tnfa的转录水平升高(图.S1B)。为了排除斑块中的衰老细胞,我们应用在P16Ink4a基因启动子控制下表达单纯疱疹病毒胸苷激酶的转基因模型P16-3MR(3MR)小鼠,并给予更昔洛韦(GCV)杀死P16Ink4a+衰老细胞。有斑块的Ldlr-/-小鼠,3MR小鼠喂饲HFD 88天,然后用GCV短期处理,与ldlr-/-小鼠(图.S1C)比较,半乳糖苷酶(SAβ-Gal)活性处于低水平 ,这表明衰老细胞得到了有效的清除。斑块用透射电子显微镜检查,显示三种不同形态类型的细胞——位于内皮细胞层中细长而含有液泡的细胞;具有血管平滑肌细胞(VSMCs)组织学特性的纺锤形泡沫细胞;和类似于产生X-半乳糖苷酶(X-Gal)晶体的载脂巨噬细胞的大泡沫细胞(图.1A)。我们把这些细胞分别称为内皮细胞样细胞、泡沫状血管平滑肌细胞样细胞和泡沫状巨噬细胞样细胞,因为这些细胞在斑块内改变了形状和生物谱系标记,而妨碍细胞起源的准确评估(15,16)。所有这三种类型的衰老细胞通过GCV(更昔洛韦)处理都得到了有效的清除(图.1A)。

为了评估衰老细胞对斑块形成的影响,我们采用了10周龄Ldlr-/-3MR小鼠;喂饲HFD 88天,并于此期间同时给它们用GCV或载体处理(图.1B),以间断地清除P16Ink4a+细胞。为了控制GCV的可能影响,独立的3MR表达,我们还检查了以GCV处理饲喂HFD的Ldlr-/-小鼠。降主动脉以苏丹Ⅳ染色,显示以GCV处理ldlr-/-3MR小鼠因其斑块的数量和体积二者均为减少和缩小,比以载体处理的Ldlr-/-3MR小鼠或GCV处理的Ldlr-/-小鼠的斑块负载降低了~60%(图.1C)。同样地,GCV处理的Ldlr-/-3MR小鼠显示负载的斑块减少,以及在头臂动脉新生内膜下的主动脉弹性纤维的破坏(图.S2,A-C)减轻,该部位快速地形成晚期动脉粥样硬化斑块⒄。与用载体处理的Ldlr-/-3MR小鼠相比,GCV处理的Ldlr-/-3MR小鼠在主动脉弓中表达的P16Ink4amRNA和其他衰老标志的mRNA的数量更少,证实P16Ink4a+衰老细胞被GCV有效地清除掉(图.S3A)。3MR的表达,由单体红荧光蛋白转录的逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析进行测定,HFD饲喂小鼠中是增加的,而用GCV处理的小鼠仍然保持在基线水平。主动脉表面的衰老相关β-半乳糖苷酶补充染色,证实P16ink4a+衰老细胞被有效地清除(图.S3B)。Ldlr-/-小鼠的GCV处理并不改变SAβ-Gal染色或其他的衰老标记(图.S3,B和C)。GCV处理Ldlr-/-小鼠以及Ldlr-/-3MR小鼠的体重、脂肪质量和脂肪沉积重量没有不同(图.S4,A-D)。循环的单核细胞、淋巴细胞、血小板和嗜中性白细胞,这些全都涉及动脉粥样硬化的发生,均未受到影响(图.S4,E-H)。GCV处理的Ldlr-/-小鼠及Ldlr-/-3MR小鼠的血液中动脉粥样硬化脂质的水平;和载体处理的Ldlr-/-3MR小鼠与饲喂LFD对照小鼠中的水平相比有很大的升高,而饲喂HFD的不同组之间没有什么差异(图.S4I)。因此,GCV处理的Ldlr-/-小鼠中抗动脉粥样硬化的作用;3MR小鼠是由于杀死了P16Ink4a+衰老细胞,而不是改变喂饲习惯、血脂或循环的免疫细胞。具有P16-3MR的小鼠,可复制2个独立的转基因系统[INK-ATTAC(图.S5)(18,19)和INK-硝基还原酶(NTR)(图.S6)]通过不同机制杀死P16Ink4a+泡沫细胞,以及用分解药ABT263抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL,并选择性地杀死衰老细胞(图.S7)⒇,因此在这些小鼠中观察到了斑块负载数量的减少和体积的缩小。

为了研究衰老细胞如何驱动斑块的发生和生长,我们专注于动脉粥样硬化易发的血管病变部位(21)。Ldlr-/-小鼠仅在导致动脉粥样硬化发生的日粮喂饲9天后,就在主动脉弓曲内可检测到明显的脂肪条纹病变(图.2A和图.S8A)。令人惊讶的是,这些早期病变具有衰老相关β-半乳糖苷酶(SAβ-Gal)活性的高阳性。相比之下,含有3MR的Ldlr -/-小鼠在喂饲HFD的9天期间,给予GCV处理,只有SAβ-Gal的低水平活性和小很多的脂肪条纹(图.2A)。SAβ-Gal染色标本通过透射电子显微镜(TEM)进行组织学检查显示,喂饲HFD的Ldlr -/-小鼠的脂肪条纹由单层或多层排列的泡沫样巨噬细胞病灶组成(图.2,B和C)。这些病变有完整的弹性纤维,但没有纤维帽。无论病变大小,只有在泡沫状巨噬细胞中检测到X-Gal的晶体(图.B和D)。每天接受高剂量GCV的Ldlr-/-3MR小鼠,其9天病灶中心的泡沫样巨噬细胞,很少排列成多层,且只有低得多的X-Gal晶体发生率(图.2,C和D)。脂肪条纹中的SAβ-Gal活性的升高,是与P16Ink4a和各种其他衰老标记物包括Mmp3、Mmp13、II1α和Tnfα水平升高相关联的(图.S8B)。HFD喂饲的Ldlr-/-小鼠,经用ABT2639的9天处理,证实脂质的分解减少了动脉粥样硬化病变的发生(图.S8C)。

为了确定衰老泡沫状巨噬细胞如何促成早期的动脉粥样硬化发生,我们使Ldlr-/- 和Ldlr-/-3MR小鼠中于9天生成了脂肪条纹,然后给予3天的高剂量GCV,并继续给小鼠喂以HFD。衰老细胞的短期清除,显著地减少了脂肪条纹的体积和SAβ-Gal的阳性度(图.2E)。TEM图像显示病灶被清除而得到彻底地改变,内皮下没有非细胞碎片残留和只有很少泡沫状巨噬细胞含有X-Gal晶体(图.S8,D和E)。RT-qPCR显示P16ink4a和SASP(衰老相关分泌表型)成分(包括Mmp3、Mmp13、II1α和Tnfα)和2个驱动单核细胞征募的关键分子(趋化因子Mcp1和白细胞受体Vcam1)明显地减少,这2个关键分子的表达在一定程度上是由Tnfα驱动的(图.2F)。这些数据表明,早期病变中内皮下衰老泡沫状巨噬细胞的出现增强了Tnfα介导的Vcam1的表达和Mcap1梯度以及血液中单核细胞的持续征募。

接着,我们检查了衰老细胞在良性斑块成熟为复杂晚期斑块中的作用。虽然动脉粥样硬化小鼠模型尚未显示与斑块破裂相关的临床症状,不过,可利用这些小鼠中成熟斑块的表示其不稳定性的标记,如纤维帽变薄(22,23)、胶原蛋白沉积减少、弹性纤维退变和斑块钙化(24)来进行研究。为了评估衰老细胞清除对现存斑块成熟的影响,我们采用了疾病晚期的衰老细胞清除程序,其中,我们给Ldlr -/-小鼠和Ldlr -/-3MR小鼠喂饲HFD88天以形成斑块,然后,进行100天的GCV处理。GCV处理期间,小鼠被饲以HFD或LFD,促使斑块分别继续发展或不发展(图.3A和图.S9)。Ldlr-/-3MR小鼠保持HFD并予以GCV处理,显示疾病进展缓慢,这可由与GCV处理Ldlr-/-小鼠或载体处理的Ldlr-/-3MR对照组(图.3A)比较,其斑块的数量更少斑块的体积更小而得到证明。而GCV处理Ldlr-/-3MR小鼠喂饲LFD的斑块与对照组小鼠的斑块,经苏丹Ⅳ染色比较,显著地减少,对照小鼠主动脉的病变复盖区没有改变(图.S10A),尽管3MR介导的衰老细胞杀死由SAβ-Gal染色(图.S10B)和RT-qPCR(图.3B)对衰老标记的检查得到证实。不论喂饲何种日粮,衰老细胞的清除减少了炎性细胞因子(图.3B)和单核细胞征募因子(图.S10C)的表达。GCV处理减少了基质金属蛋白酶相联系的斑块不稳定因子包括Mmp3、Mmp12和Mmp13(25,26)(图.3B)的表达,这表明衰老细胞的清除稳固了纤维帽。

为了研究这种以及其他的斑块成熟特性,我们分析了自以上组列收集斑块的组织病理学。当Ldlr-/-小鼠开始喂饲HFD 88天接着再喂饲这种日粮100天,与那些饲喂LFD的小鼠比较,它们的降主动脉斑块显示减少了纤维帽的厚度、减少了胶原蛋白的含量(马森氏三色染色)、主动脉的弹性纤维受到更多的破坏(费尔哈夫冯胶原纤维染色)(图.4,A和B,和图.S11)。相反,随着P16Ink4a+细胞的清除,不论喂饲何种日粮,在100天GCV处理期间,这些斑块不稳定性标记物均减少。同样地,P16Ink4a+细胞的清除,那些恢复LFD喂饲小鼠头臂动脉中斑块的纤维帽厚度和胶原蛋白含量均有增加(图.S12)。我们通过ldlr-/-3MR小鼠和Ldlr-/-小鼠,在喂饲HFD88天后,换喂LFD,并注射GCV 35天以延长这些研究(图.S13A)。在这个实验中,衰老细胞的清除,使纤维帽的厚度得到了保持(图.S13,B和C)。此外,病变的泡沫状巨噬细胞样细胞含量减少,而血管平滑肌细胞样细胞含量增高(图.S13,D和E),导致斑块具有一个更大稳定性的标志,即更高的血管平滑肌细胞样细胞/巨噬细胞样细胞的比率(图.S13F)(27)。清除衰老细胞,显著地减少了附着于邻接内皮细胞斑块上的单核细胞(图.S13G),从而支持我们从早期脂肪条纹实验中得出的结论,该实验增强了单核细胞的化学趋向性,可能部分地解释衰老细胞的促动脉粥样硬化的性质。这些结果强烈地表明,清除P16Ink4a+细胞,提高了斑块的稳定性。

为了进一步研究衰老细胞驱动动脉粥样硬化发生的机制,我们测试了这种衰老细胞在斑块中表达促动脉粥样硬化因子的可能性。我们仔细检查了采自喂饲HFD的Ldlr-/-ATTAC小鼠组织承载的病变,制备了单细胞悬浮液,利用依赖绿色荧光蛋白(GFP)表达的P16INK4a,通过ATTAC收集GFP+ 衰老细胞和GFP- 非衰老细胞群体,用于RT-qPCR分析(图.4C)。衰老细胞中表达一群广谱的促动脉粥样硬化因子,包括II1α,Tnfa,Mmp3,Mmp12,Mmp13,Mcp1和Vcam1(图.4C)。与非衰老细胞中表达的相比,该亚群的这些因子(包括II1α、Mmp12、Mmp13和Mcp1)所表达的水平显著地升高。

使用转基因的和药理学的两种方法,清除P16Ink4a+细胞,使没有衰老程序干扰,我们证明衰老细胞在整个动脉粥样硬化过程中始终是有害的。最早的脂肪条纹含有丰富的衰老泡沫样巨噬细胞,它通过上调炎性细胞因子和单核细胞趋化因子,创建了一个有利于病变进一步增长的环境。从脂肪条纹中去除P16Ink4a+泡沫样巨噬细胞而导致病变的显著消除而康复。相比之下,晚期病变含有三种不同形态类型的衰老细胞,它们不仅通过炎症反应和单核细胞趋化性驱动病变成熟,而且还促进细胞外基质的降解。清除晚期病变,既抑制了斑块的增长,又减弱了与适应不良现象包括纤维帽变薄和弹性纤维退变的斑块破裂相关的重构过程。比较起来,其他因子如Mmp3、Tnfα和Vcam1的表达随着分解作用而减少,但这些因子在P16Ink4a+细胞中是不丰富的,这意味着衰老细胞也可间接地影响促动脉粥样硬化的发生环境。总的说来,我们的结果表明,衰老细胞在所有阶段通过旁分泌活动驱动动脉粥样硬化,以及提高没有毒副作用的药物样分子从患者除去衰老细胞的可能性,这可能有助于本病的治疗管理。

材料和方法

动物模型

C57BL/6 Ldlr -/-小鼠购自杰克逊实验室(鼠种号002207),与先前所述C57BL/6 P16-3MR小鼠⒁杂交产生Ldlr+/-3MR小鼠,然后其与C57BL/6 Ldlr-/-小鼠交配产生Ldlr-/-3MR雄鼠。用于实验的雌鼠由Ldlr-/-3MR雄鼠与C57BL/6 Ldlr-/-雌鼠交配获得。实验小鼠含有一单个3MR转基因拷贝。INK-ATTAC转基因小鼠如⒆所述,是在C57BL/6遗传背景上产生的。这些小鼠含有整合于一单个基因组的基因座的~13个INK-ATTAC转基因串联拷贝。按照产生Ldlr-/- 3MR小鼠所述进行在Ldlr-/- 背景上繁殖INK-ATTAC转基因小鼠和产生实验组队列。实验小鼠为INK-ATTAC半合子。INK-ATTAC小鼠通过用一个EGFP-NTR融合基因(NTR扩增自大肠杆菌BL21)(28)取代INK-ATTAC转基因盒的FKBP-Casp8-IRES-EGFP片段。把此转基因注入FVB受精卵,产生14个转基因个体,其中8个具有BubR1早衰背景⒅。如⒅所述,对每个同窝产出的BubR1H/HINK-NTR和BubR1H/H的新建系,在断乳年龄开始给予含有4.5g/L MTZ(Sigma-Aldrich公司)和90g/L糖的水自由饮用,随后,监测白内障、驼背和脂质代谢异常的发生时间。两个转基因系小鼠的这些特性显著地减弱,其中的一个选择用于繁殖Ldlr-/-小鼠(系18;这些小鼠具有FVB×129Sv/E×C57BL/6混合遗传背景)。我们通过Ldlr -/-INK-NTR雄鼠与C57BL/6 Ldlr -/-雌鼠交配,获得实验用小鼠。用于实验的ldlr -/-INK-NTR雌鼠是INK-NTR的半合子,至少已与C57BL/6回交了3代。全部小鼠的实验,均遵照研究机构动物护理和使用委员会的指南进行。小鼠被饲养于无病原的环境内。

动脉粥样硬化的诱发和衰老细胞的清除

为了诱生动脉粥样硬化,雌性小鼠在10周龄开始喂饲42%热量来自脂肪(Harlan-Teklad公司,TD.88137)所组成的发生动脉粥样硬化日粮。图.1和图.S1-S7中的进展性研究中使用的、在处死前喂饲HFD88天(12.5周)的小鼠,其中除外图.S5所用小鼠饲喂HFD 102天。用于研究的3MR系统小鼠,每千克体重用5毫克更昔洛韦(GCV)溶于PBS,给Ldlr -/- 小鼠对照组和Ldlr-/-3MR实验小鼠腹腔内注射,每日1次连续5天,接着14天不注射后,再重复一个研究周期。给作为用于转基因插入效应作对照的、并也饲喂HFD的Ldlr-/-3MR小鼠注射PBS。研究中使用甲硝哒唑,Ldlr-/-小鼠对照组和Ldlr-/-NTR实验小鼠,给予含有4.5g/L甲硝哒唑(Sigma-Aldrich公司)和90g/L食糖的水自由饮用。研究中使用AP20187,Ldlr-/-对照组和ldlr-/-ATTAC实验小鼠如⒆所述,在研究期间每2周腹腔注射1次,每千克体重2mg AP20187.

在图.2和图.S8中,为了诱生脂肪条纹,Ldlr-/-和Ldlr-/-3MR小鼠被喂饲HFD 9天,以及每天注射1次溶于PBS的25mg/kg GCV(在主文本中称为高剂量GCV)或在载体中的100mg/kg ABT263(PBS中含有15% DMSO/7% 吐温-20)。为了恢复脂肪条纹,预喂小鼠HFD 9天,接着再喂3天HFD及每天3次腹腔注射溶于PBS的25mg/kg GCV。

图.3-4和图.S9-11中,通过给Ldlr-/- 和Ldlr-/-3MR小鼠喂饲HFD 188天,在最后的100天按5天给予PBS载体或5mg/kg GCV处理及14天的不处理周期循环,进行衰老在斑块生长后期中所起作用的研究。图.3-4和图.9-13中小鼠喂HFD 88天,接着换回非形成动脉粥样硬化的标准幅照颗粒饲料日粮(实验室饲料#5053,13.205%热量来自脂肪)与载体或GCV按上述方法处理,研究了在血脂不再进一步异常下已形成斑块中衰老所起的作用。非动脉粥样硬化对照组小鼠,终生喂饲同一种非动脉粥样硬化日粮,在该研究的最后100天用PBS载体处理。

血液分析

小鼠于处死前,通过采用肝素化的毛细管穿剌眼眶后部收集血液。经EDTA处理的全血使用Hemavet 950(杜鲁科学股份有限公司,迈阿密湖,佛鲁里达州,美国)分析评估循环细胞的血液学总值。全血经EDTA处理,接着在4℃ 3500g 离心15分钟。脂质分析,由梅奥诊所免疫化学核心实验室使用高效液相色谱法(HPLC)测定。

衰老相关半乳糖苷酶(SAβ-Gal)染色和染色斑块的电镜观察

SAβ-Gal的主动脉染色,用一试剂盒遵照制造商(细胞信号公司)说明书进行。切取整个主动脉,在固定前贮存于冰上的PBS中。主动脉于室温固定15分钟,PBS冲洗2次,在37℃的染色液中染色12小时。按⒆所述进行SAβ-Gal染色斑块的电镜观察(Gal-EM)。简言之,染色后的斑块,在特朗普氏定影剂中于室温保持4小时,接着进行标准的EM过程(通过二甲苯-酒精系列脱水,接着用四氧化锇染色和用环氧树脂包埋)。图.1中SAβ-Gal阳性细胞的定量,每个降主动脉斑块的2个不相邻薄切片被用于分析,承载有1个或更多个立方形或针形半乳糖苷晶体(X-Gal),被认为是半乳糖苷酶阳性(X-Gal+)。经形态学鉴定出泡沫状巨噬细胞、血管平滑肌(VSMC)样细胞、内皮细胞样细胞和附着的单核细胞。简言之,细胞大致成圆形和整个细胞质内被液泡占据者,被认为是巨噬细胞样细胞。纺锤状和高度分枝成网状的,在高尔基体/内质网中富含致密电子,主要为非液泡化胞质,被认为是血管平滑肌样细胞。细胞位于斑块表面,具有细长的核和长而薄的细胞质的,被认为是内皮细胞。这些形态评估,根本不考虑细胞的起源,而是考虑病变中的细胞类型的普遍变换,因此,为了获得细胞宽泛的表型分类,而把细胞描述为“-样”。除外被分析的3个或更多个跨越主动脉弓内部弯曲的薄切片,基于相同的形态学细胞类型鉴定方案,被用于图.2和图.S8中Gal-EM的脂质条纹分析,。图.S13中是斑块组织学参数的定量,每个降主动脉斑块分析一个或多个薄切片。每个切片600倍放大的TEM图像,使用ImageJ软件,在15个相等分散位点测定纤维帽的厚度。这些相同切片上VSMC样细胞和巨噬细胞样细胞的含量,在1500倍放大和规格化斑块切面断面区,手工计数所有这样的细胞。附着的单核细胞,仅发现于与斑块相邻的内皮细胞上,每个斑块计数2个不相邻切片,由于各组之间相邻血管壁的数量大致是相等的,所以,只提供没有规格化的内皮细胞数量。

斑块的表面染色

如前所述(29),切取整段主动脉,清除血管外膜的脂肪,剪开,用针固定成平面,于室温在4%多聚甲醛(PFA)中固定12小时。用针钉成平面的主动脉,以70%的乙醇洗涤5分钟,在苏打Ⅳ工作溶液(0.5%苏打Ⅳ溶于丙酮∶乙醇∶1∶1)中浸5分钟,接着用80%乙醇分化三次每次30秒。对所有实验中对照组和实验组的主动脉,均同时进行染色。用ImageJ软件进行苏打Ⅳ+染色区总面积的定量,在40倍放大下计数斑块量。

流式细胞术

把从喂饲HFD 6个月的Ldlr-/-ATTAC小鼠和Ldlr-/-小鼠分离得到的,负载有病变的主动脉弓和腹主动脉,放置于冰冷的PBS中,洗涤3次,然后,在含有1mg/mL释放酶(罗氏生命科学公司)的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中,细致地切碎。样本于37℃孵育1小时,期间每10分钟倒置1次,通过火抛光移液管10X 研磨30分钟,最后,结束裂解组织的消化。样本通过70 um尼龙细胞过滤器,过滤器以2 mL HBSS和5% 正常山羊血清(NGS)冲冼以收集细胞,细胞于4℃ 以300g 4分钟成粒,再悬浮于0.75 mL 的HBSS和5% NGS 中。样本在流式分类前,贮放于冰上。门选经绿色荧光蛋白通道中的自发荧光处理,用Ldlr-/-小鼠病变细胞作阴性对照。细胞在Arias流式细胞仪(非灭菌,4℃)上分类,直接地进入RNease微型试剂盒裂解缓冲液(含有1% β-硫基乙醇的RLT)。样本遵照制造商的方案,RNA在分离前储存于冰上,分离后的RNA在-80℃储存。

RT-qPCR

如⒆所述,从经过研磨的主动脉弓或如上所述从流式分选的细胞中提取总RNA。使用上标Ⅲ第一链cDNA合成试剂盒,遵照制造商方案制备cDNA。遵照制造商的建议,使用Sybr绿色荧光染料于qRT-PCR,以及靶基因对个体样本磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)水平的表达进行了规范化。用于扩增P16Ink4a、P19Arf、P21、Mmp3、Mmp13、II1α和mRFP转录的引物,如先前(14,19)所述。Mmp1正向5´-CCATCGCGAGAGCCTTTAGA-3´,反向5´-TCGCCTTCCTCCTCAAAGAC-3´;Mmp2正向5´-GGGGTCCATTTTCTTCTTCA-3´,反向5´-CCAGCAAGTAGATGCTGCCT-3´;Mmp9正向5´-GTGGTTCAGTTGTGGTGGTG-3´,反向5´-CCCGCTGTATAGCTACCTCG-3´;Mmo12正向5´-TTCATGAACAGCAACAAGGAA-3´,反向5´-TTGATGGCAAAGGTGGTACA-3´;VCAM1正向5´-CCGGCATATACGAGTGTAAA-3´,反向5´-TAGAGTGCAAGGAGTTCGGG-3´;ICAM1正向5´-AACAGTTCACCTGCACGGAC-3´,反向5´-GTCACCGTTGTGATCCCTG-3´;Cd11b正向5´-GTTTGTTGAAGGCATTTCCC-3´,反向5´-ATTCGGTGATCCCTTGGATT-3´;Mcp-1正向5´-CCTGCTGTTCACAGTTGCC-3´,反向5´-ATTGGGATCATCTTGCTGGT-3´。

斑块的组织学评估

经处理的单个降主动脉斑块和完整的头臂动脉,接着分别在4% PFA(多聚甲醛)或10%中性缓冲的福尔马林中于室温固定12小时。全部切片均为5um厚度。对于降主动脉斑块,相距250um的切片上至少承载2个斑块,并评定所有的参数。对头臂动脉,从头臂动脉根部至右颈总动脉与锁骨下动脉的分岔处止,以相距200um的均匀方式采集切片并评分。常规的H & E(苏木素和伊红)染色与马森氏三色(Sigma-Aldrich公司)或Voerhoff von Gieson(Polyscientific R&D公司)染色结合,以分别测量纤维帽厚度和折断的弹性纤维。纤维帽被定义为嗜伊红、阿尔新蓝-阳性结构覆盖斑块核心,至多有一个泡沫样巨噬细胞覆盖或贯穿纤维帽。对每张斑块切片测定帽的15处相等分散的厚度。胶原蛋白的百分比,以测定马森氏三色中蓝染区面积,与所测定离血管内壁最近的弹性纤维以上的斑块横截面积之比来计算。

统计分析

Prism软件被用于所有的统计分析。学生氏双尾T检验与韦尔奇氏修正,仅用于确定所有涉及两组比较的差异显著性。对所有涉及3个或更多组的实验进行方差分析,和通过Sidak整体误差率校正的多重比较进行补偿。为了一致性,全部图的误差线表示平均数和显著性的标准误差,由下列P值表示:* P<0.05;** P<0.01;*** P<0.001。生物的数量“N”,在所有的图中,均直接地标明。


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